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生物樣品的預處理
日期：2025-07-09 10:25
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摘要：
生物樣品的預處理
由于生物樣品中含有大量有機物（母質），且所含有害物質一般都在痕量和超痕量級范圍，因此測定前必須對樣品進行分解，對欲測組分進行富集和分離，或對干擾組分進行掩蔽等。這些工作屬于預處理。
一、消解和灰化
測定生物樣品中的微量金屬和非金屬元素時，通常都要將其大量有機物基體分解，使欲測組分轉變成簡單的無機化合物或單質（如汞），然后進行測定。分解有機物的方法有濕法消解和干法灰化。這兩種方法的基本內容在**章已介紹，此處僅結合生物樣品的分解略述之。
（一）濕法消解
濕法消解生物樣品常用的消解試劑體系有：硝酸-高氯酸、硝酸-硫酸、硫酸-過氧化氫、硫酸-高錳酸鉀、硝酸-硫酸-五氧化二釩等。
對于含大量有機物的生物樣品，特別是脂肪和纖維素含量高的樣品，如肉、脂肪、面粉、稻米、秸桿等，加熱消解時易產(chǎn)生大量泡沫，容易造成被測組分的損失。若先加硝酸，在常溫下放置24h后再消解，可大大減少泡沫的產(chǎn)生。在某些情況下，可以加入防起泡劑（見表6-8）。
表6-8 蒸發(fā)及濕法消解樣品用的防起泡劑
采用硝酸-硫酸消解法，能分解各種有機物，但對吡啶及其衍生物（如煙堿）、毒殺芬等分解不完全。樣品中的鹵素在消解過程中可完全損失，汞、砷、硒等有一定程度的損失。
硝酸-高氯酸消解生物樣品是破壞有機物比較有效的方法，但要嚴格按照操作程序，防止發(fā)生爆炸。
硝酸-過氧化氫消解法應用也比較普遍，有人用該方法消解生物樣品測定氮、磷、鉀、硼、砷、氟等元素。
高錳酸鉀是一種強氧化劑，在中性、堿性和酸性條件下都可以分解有機物。測定生物樣品中汞時，用1∶1硫酸和硝酸混合液加高錳酸鉀，于6O℃保溫分解魚、肉樣品；用5％高錳酸鉀的硝酸溶液于85℃回流消解食品和尿液；用硫酸加過量高錳酸鉀分解尿樣等，都可獲得滿意的效果。
測定動物組織、飼料中的汞，使用加五氧化二釩的硝酸和硫酸混合液催化氧化，溫度可達190℃，能破壞甲基汞，使汞全部轉化為無機汞。
生物樣品中氮的測定，沿用凱氏消解法，即在樣品中加濃硫酸消解，使有機氮轉化為銨鹽。為提高消解溫度，加速消解過程，可在消解液中加入硫酸銅、硒粉或硫酸汞等催化劑。加硫酸鉀對提高消解溫度也可起到較好的效果。以—NH2及=NH形態(tài)存在的有機氮化合物，用硫酸、硝酸加催化劑消解的效果是好的，但雜環(huán)、N—N鍵及硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮不能定量轉化為銨鹽，可加入還原劑如葡萄糖、苯甲酸、水楊酸、硫代硫酸鈉等，使消解過程中發(fā)生一系列復雜氧化還原反應，則能將硝態(tài)氮還原為氨。
用過硫酸鹽（強氧化劑）和銀鹽（催化劑）分解尿液等樣品中的有機物可獲得較好的效果。
近年來，應用增壓溶樣法分解有機物樣品和難分解的無機物樣品有所發(fā)展。該方法將生物樣品放入外包不銹鋼殼的聚四氟乙烯坩堝內，加入混合酸或氫氟酸，在140—160℃保溫2—6h，即可將有機物分解，獲得清亮的樣品溶液。隨著聚四氟乙烯加工技術的提高，外面不用鋼殼保護，已開始推廣應用。
（二）灰化法
灰化法分解生物樣品不使用或少使用化學試劑，并可處理較大稱量的樣品，故有利于提高測定微量元素的準確度。但是，因為灰化溫度一般為450—550℃，不宜處理測定易揮發(fā)組分的樣品。此外，灰化所用時間也較長。
根據(jù)樣品種類和待測組分的性質不同，選用不同材料的坩堝和灰化溫度。常用的有石英、鉑、銀、鎳、鐵、瓷、聚四氟乙烯等材質的坩堝。部分生物和食品樣品的灰化溫度列于表6-9。
表6-9 部分生物和食品樣品的灰化溫度
通?；一飿悠凡患悠渌噭?，但為促進分解，抑制某些元素揮發(fā)損失，常加適量輔助灰化劑，如加入硝酸和硝酸鹽，可加速樣品的氧化，疏松灰分，利于空氣流通；加入硫酸和硫酸鹽，可減少氯化物的揮發(fā)損失；加入堿金屬或堿土金屬的氧化物、氫氧化物或碳酸鹽、醋酸鹽，可防止氟、氯、砷等的揮發(fā)損失；加入鎂鹽，可防止某些待測組分和坩堝材料發(fā)生化學反應，抑制磷酸鹽形成玻璃狀熔融物包裹未灰化的樣品顆粒等。但是，用碳酸鹽作輔助灰化劑時，會造成汞和鉈的全部損失，硒、砷和碘有相當程度的損失，氟化物、氯化物、溴化物有少量損失。表6-10列舉出測定某些生物樣品中氟，用干灰法分解樣品加入的輔助灰化劑和控制條件。
表6-10 干灰法處理測氟生物樣品的輔助灰化劑
樣品灰化完全后，經(jīng)稀硝酸或鹽酸溶解供分析測定。如酸溶液不能將其完全溶解時，則需要將殘渣加稀鹽酸煮沸，過濾，然后再將殘渣用堿融法灰化。也可以將殘渣用氫氟酸處理，蒸干后用稀酸溶解供測定。
隨著低溫灰化技術的發(fā)展，使測定生物樣品中易揮發(fā)元素，如砷、汞、硒、氟等取得很好的效果。高頻電場激發(fā)氧灰化技術是用高頻電場激發(fā)氧氣產(chǎn)生激發(fā)態(tài)氧原子處理樣品，一般在150℃以下就可使樣品完全灰化。氧瓶燃燒法也是一種簡易低溫灰化方法。該方法將樣品包在無灰濾紙中，濾紙包鉤掛在繞結于磨口瓶塞的鉑絲上，瓶內放入適當吸收液（如測氟用0.1mol/LNaOH溶液；測汞用硫酸-高錳酸鉀溶液等），并預先充入氧氣。將濾紙點燃后，迅速插入瓶內，蓋嚴瓶塞，使樣品燃燒灰化。待燃燒盡，搖動瓶內溶液，使燃燒產(chǎn)物溶解于吸收液，吸收液供測定。
氧彈法可用于灰化測定汞、硫、砷、氟、硒、硼、氚和14碳等組分的生物樣品。將樣品研成粉末并壓成片，放入樣品杯，裝在有鉑內襯的氧彈內（50—300mL，內有吸收液），旋緊蓋，充入純氧氣，用電火花引發(fā)樣品燃燒，燃燒產(chǎn)物被吸收液吸收后供測定。表6-11列舉了部分生物樣品灰化實例。
表6-11 氧彈法灰化生物樣品實例
二、提取和濃縮
測定生物樣品中的農(nóng)藥、石油烴、酚等有機污染物時，需要用溶劑將欲測組分從樣品中提取出來，提取效率的高低直接影響測定結果的準確度。如果存在雜質干擾和待測組分濃度低于分析方法的*低檢測濃度問題，還要進行凈化和濃縮。
隨著近代分析技術的發(fā)展，對環(huán)境樣品中的污染物已從單獨分析發(fā)展到多種污染物連續(xù)分析。因此，在進行污染物的提取、凈化和濃縮時，應考慮到多種污染物連續(xù)分析的需要。
（一）提取方法
提取生物樣品中有機污染物的方法應根據(jù)樣品的特點，待測組分的性質、存在形態(tài)和數(shù)量，以及分析方法等因素選擇。常用的提取方法有：振蕩浸取法、組織搗碎提取法和脂肪提取器提取法。
1.振蕩浸取法
蔬菜、水果、糧食等樣品都可使用這種方法。將切碎的生物樣品置于容器中，加入適當?shù)娜軇?，放在振蕩器上振蕩浸取一定時間，濾出溶劑后，用新溶劑洗滌樣品濾殘或再浸取一次，合并浸取液，供分析或進行分離、富集用。
2.組織搗碎提取
取定量切碎的生物樣品，放入組織搗碎杯中，加入適當?shù)奶崛?，快速搗碎3—5min，過濾，濾渣重復提取一次，合并濾液備用。該方法提取效果較好，應用較多，特別是從動植物組織中提取有機污染物質比較方便。
3.脂肪提取器提取
索格斯列特（Soxhlet）式脂肪提取器，簡稱索氏提取器或脂肪提取器，常用于提取生物、土壤樣品中的農(nóng)藥、石油類、苯并（a）芘等有機污染物質。其提取方法是：將制備好的生物樣品放入濾紙筒中或用濾紙包緊，置于提取筒內；在蒸餾燒瓶中加入適當?shù)娜軇B接好回流裝置，并在水浴上加熱，則溶劑蒸氣經(jīng)側管進入冷凝器，凝集的溶劑滴入提取筒，對樣品進行浸泡提取。當提取筒內溶劑液面超過虹吸管的頂部時，就自動流回蒸餾瓶內，如此重復進行。因為樣品總是與純溶劑接觸，所以提取效率高，且溶劑用量小，提取液中被提取物的濃度大，有利于下一步分析測定。但該方法費時，常用作研究其他提取方法的對照比較方法。
4.直接球磨提取法
該方法用己烷作提取劑，直接將樣品在球磨機中粉碎和提取，可用于提取小麥、大麥、燕麥等糧食中的有機氯及有機磷農(nóng)藥。由于不用極性溶劑提取，可以避免以后費時的洗滌和液-液萃取操作，是一種快速提取方法。提取用的儀器是一個50mL的不銹鋼管，鋼管內放兩個小鋼球，放入1—5g樣品，加 2—8g無水硫酸鈉，20mL己烷，將鋼管蓋緊，放在350r/min的搖轉機上，粉碎提取30min即可，回收率和重現(xiàn)性都比較好。
選擇提取劑應考慮樣品中欲測有機污染物的性質和存在形式，因為生物樣品中有機污染物一般含量都很低，故要求用高純度的溶劑。例如，測定農(nóng)藥殘留量，一般要求所用溶劑中雜質含量在10g以下。普通溶劑應進行純化處理。
此外，提取劑還應根據(jù)“相似相溶”原理選擇。如對于極性小的有機氯農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯等，用極性小的己烷、石油醚等提??；而對于極性較強的有機磷農(nóng)藥和強極性的含氧除草劑等，原則上要選用強極性溶劑提取，如二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮等。
一般認為提取劑的沸點在45—80℃之間為宜。沸點太低，容易揮發(fā)；沸點太高，不易濃縮富集，而且在濃縮時會使易揮發(fā)或熱穩(wěn)定性差的污染物損失。
其他，如溶劑的毒性、價格以及對檢測器是否有干擾等也是應考慮的因素。
為提高提取效果，可選用單一溶劑，也可用混合溶劑。常用的提取劑有：正己烷、石油醚、乙腈、丙酮、苯、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲酰胺等。常用的混合溶劑體系有：正己烷（或石油醚）- 丙酮、乙腈-水、正己烷（或石油醚）-乙醚、正己烷（或石油醚）-異丙醇、正己烷（或石油醚）-二氯甲烷、甲醇-三氯甲烷、正己烷（或石油醚）-乙腈、正己烷（或石油醚）-甲醇、三氯甲烷-乙酸乙酯等。
對于含多種復雜組分樣品的系統(tǒng)分析，還可用多種溶劑分別進行多次提取。
（二）分離
用提取劑從生物樣品中提取欲測組分的同時，不可避免地會將其他相關組分提取出來。例如，用石油醚等提取有機氯農(nóng)藥時，也將脂肪、臘質、色素等一起提取出來。因此，在測定之前，還必須將上述雜質分離出去。常用的分離方法有：液-液萃取法、層析法、磺化法、低溫冷凍法、吹蒸法、液上空間法等。
1.液-液萃取法
液-液萃取法是依據(jù)有機物組分在不同溶劑中分配系數(shù)的差異來實現(xiàn)分離的（見**章）。例如，農(nóng)藥與脂肪、蠟質、色素等一起被提取后，加入一種極性溶劑（如乙腈）振搖，由于農(nóng)藥的極性比脂肪、蠟質、色素要大一些，故可被乙腈萃取。經(jīng)幾次萃取，農(nóng)藥幾乎完全可以與脂肪等雜質分離，達到凈化的目的。農(nóng)藥殘留量分析中的液-液萃取多屬用極性溶劑從非極性溶劑中提取，為表示這種萃取方法的效果，引入了p值的概念。所謂p值是指在體積相等的兩種互不相溶的溶劑中分配達平衡時某種農(nóng)藥存在于非極性溶劑中的份數(shù)。相應的該農(nóng)藥存在于極性溶劑中的份數(shù)用q值表示。顯然，p+q=1。根據(jù)分配系數(shù)的概念，該情況下分配系數(shù)K可表示為如下形式：
若p值等于0.70，表明等體積分配達到平衡時，有70％的農(nóng)藥存在于非極性溶劑中，其余30％存在于極性溶劑中?？梢?，p值越小，存在于極性溶劑中的農(nóng)藥越多，越有利于用極性溶劑從非極性溶劑中萃取農(nóng)藥。表6-12列出幾種常用農(nóng)藥在兩種溶劑體系中的p值。用極性溶劑等體積多次萃取非極性溶劑中的農(nóng)藥，其萃取份數(shù)可用下式計算：
E非=Pn
E極=1-Pn
式中：E非——非極性溶劑中農(nóng)藥的份數(shù)；
E極——極性溶劑中農(nóng)藥的份數(shù)；
n——萃取次數(shù)。
如果用非極性溶劑多次等體積提取極性溶劑中的農(nóng)藥，其萃取份數(shù)計算式如下：
E極=（1-p）n
E非=1-（1-p）n
在實際工作中，有時用極性溶劑多次不等體積萃取非極性溶劑中的農(nóng)藥，此時按下式計算萃取率：
。
2.層析法
層析法分為柱層析法、薄層層析法、紙層析法等。其中，柱層析法在處理生物樣品中用的較多。這種方法的原理是將生物樣品的提取液通過裝有吸附劑的層析柱，則提取物被吸附在吸附劑上，但由于不同物質與吸附劑之間的吸附力大小不同，當用適當?shù)娜軇┝芟磿r，則按照一定的順序被淋洗出來，吸附力小的組分先流出，吸附力大的組分后流出，使它們彼此得以分離。
吸附劑分為無機吸附劑和有機吸附劑。常用的無機吸附劑有硅酸鎂、氧化鋁、活性炭、硅藻土等；有機吸附劑有纖維素、高分子微球、網(wǎng)狀樹脂等。
用經(jīng)活化的硅酸鎂制備的層析柱是分離農(nóng)藥常用的凈化柱。表6-13列出以乙醚-石油醚混合液為淋洗溶劑的硅酸鎂層析柱分離各種農(nóng)藥的情況。說明淋洗液的極性依次增大，淋洗下來的農(nóng)藥極性也依次增大。
3.磺化法和皂化法
磺化法是利用提取液中的脂肪、臘質等干擾物質能與濃硫酸發(fā)生磺化反應，生成極性很強的磺酸基化合物，隨硫酸層分離，而達到與提取液中農(nóng)藥分離的目的。然后，經(jīng)洗去殘留的硫酸、脫
表6-12 幾種常用農(nóng)藥的p值(25.5℃±0.5)
表6-13 硅酸鎂-乙醚-石油醚層析體系分離農(nóng)藥
水，得到純化的提取液。該方法常用于有機氯農(nóng)藥的凈化，對于易被酸分解或與之起反應的有機磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥，則不適用。
皂化法是利用油脂等能與強堿發(fā)生皂化反應，生成脂肪酸鹽而將其分離的方法。例如，用石油醚提取糧食中的石油烴，同時也將油脂提取出來，如在提取液中加入氫氧化鉀-乙醇溶液，油脂與之反應生成脂肪酸鉀鹽進入水相，而石油烴仍留在石油醚中。
4.低溫冷凍法
該方法基于不同物質在同一溶劑中的溶解度隨溫度不同而不同的原理進行彼此分離的。例如，將用丙酮提取生物樣品中農(nóng)藥的提取液置于-70℃的冰-丙酮冷阱中，則由于脂肪和臘質的溶解度大大降低而沉淀析出，農(nóng)藥仍留在丙酮中。經(jīng)過濾除去沉淀，獲得經(jīng)凈化的提取液。這種方法的*大優(yōu)點是有機化合物在凈化過程中不發(fā)生變化，并且有良好的分離效果。
5.吹蒸法和液上空間法
吹蒸法又稱氣提法，即用氣體將溶解在溶液中的揮發(fā)性物質分離出來，適用于一些易揮發(fā)農(nóng)藥和揮發(fā)油的分離。該方法的操作過程是用乙酸乙酯提取生物樣品中的農(nóng)藥，取相當于2g樣品的提取液1mL，分四次注入Storherr管，該管內填充玻璃棉、砂子等，一般加熱到180—250℃，并以600mL/min流速吹入氮氣。每次進樣后吹3min，*后再用250μL乙酸乙酯吹洗一次。經(jīng)這樣處理后，提取液中的脂肪、臘質、色素等高沸點雜質仍留在Storherr管中，農(nóng)藥則被氮氣流攜帶，經(jīng)聚四氟乙烯冷螺旋管收集于玻璃管中，達到分離的目的。方法快速、簡便，凈化一個樣品約需20min。
液上空間法是根據(jù)氣液平衡分配的原理與氣相色譜相結合，用于生物樣品中揮發(fā)性組分的分離和測定技術。將樣品提取液移入密閉容器中，稍提高容器的溫度，經(jīng)平衡一定時間后，抽取提取液上空的氣體注入色譜儀分析。如果改用吹氣和疏水性吸附劑富集，再經(jīng)洗脫后進行色譜分析，則檢測限還可降低，但必須選擇合適的吸附劑、吸附和解吸條件及氣提速度。
（三）濃縮
生物樣品的提取液經(jīng)過分離凈化后，其中的污染物濃度往往仍達不到分析方法的要求，這就需要進行濃縮。常用的濃縮方法有：蒸餾或減壓蒸餾法、K-D濃縮器濃縮法、蒸發(fā)法等。其中，K-D濃縮器法是濃縮有機污染物的常用方法。
K-D濃縮器是一種高效濃縮儀器。早期的儀器在常壓下濃縮，近些年加上了毛細管，可進行減壓濃縮，提高了濃縮速度。生物樣品中的農(nóng)藥、苯并（a）芘等極毒、致癌性有機污染物含量都很低，其提取液經(jīng)凈化分離后，都可以用這種方法濃縮。為防止待測物損失或分解，加熱K-D濃縮器的水浴溫度一般控制在50℃以下，*高不超過80℃。特別要注意不能把提取液蒸干。若需進一步濃縮，需用微溫蒸發(fā)。如用改進后的微型Snyder柱再濃縮，可將提取液濃縮至 0.1—0.2mL。
