吸光光度法一般僅適用于微量組分的測(cè)定，當(dāng)待測(cè)定組分濃度過(guò)高或過(guò)低，亦即吸光度測(cè)量值過(guò)大或過(guò)小時(shí)，從上節(jié)的測(cè)量誤差的討論得知，在這種情況下即使沒(méi)有偏離朗伯—比耳定律的現(xiàn)象，也會(huì)有很大的測(cè)量誤差，導(dǎo)致準(zhǔn)確度大為降低。采用示差法可克服這一缺點(diǎn)。目前主要有高濃度示差法，稀溶液示差法和使用兩個(gè)參比溶液的精密示差法。其中以高濃度示差法應(yīng)用*多，本節(jié)將著重討論。

示差光度法和一般的光度法不同之處主要在于，示差法不是以空白溶液（不含待測(cè)組分的溶液）作為參比溶液，而是采用比待測(cè)溶液濃度稍低的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比溶液，然后測(cè)量待測(cè)溶液的吸光度，再?gòu)臏y(cè)得的吸光度求出它的濃度。這樣便大大提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。

設(shè)用作參比的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為c_s，待測(cè)溶液濃度為c_x，且c_x>c_s，根據(jù)朗伯—比耳定律得到

兩式相減：

                                   =εb（c_x-c_s）=εbΔc                  （2-12）

實(shí)際操作是：用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比，調(diào)節(jié)其吸光度為零（透光率100%），然后測(cè)量待測(cè)溶液的吸光度。這時(shí)測(cè)得的吸光度實(shí)際是這兩種溶液吸光度的差值（相對(duì)吸光度）。從（2-12）式可知，所測(cè)得的吸光度差值與這兩種溶液的濃度差成正比。這樣便可以把空白溶液為參比的稀溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線作為ΔA對(duì)應(yīng)于Δc的工作曲線，根據(jù)測(cè)得的ΔA找出相應(yīng)的Δc值，從c_x=c_s+Δc，便可求出待測(cè)溶液之濃度，這就是示差法定量測(cè)定的基本原理。

用示差法測(cè)定濃度過(guò)高或過(guò)低試液，其準(zhǔn)確度比一般分光光度法高。這可從圖2-3看出。設(shè)

圖2-3 示差法標(biāo)尺原理

按一般分光光度法用試劑空白作參比溶液，測(cè)得溶液的透光率T_x=6%，顯然，這時(shí)的測(cè)量讀數(shù)誤差是很大的。采用示差法時(shí)，如果按一般分光光度法測(cè)得的Ts=10%的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比溶液，使其透光率從標(biāo)尺上Ts₁=10%處調(diào)至Ts₂=100%處，相當(dāng)于把檢流計(jì)上的標(biāo)尺擴(kuò)展到原來(lái)的十倍（T_S2/T_S1=100/10=10），這樣待測(cè)試液透光率原來(lái)為6%，讀數(shù)落在光度計(jì)標(biāo)尺刻度很密，測(cè)量誤差很大的區(qū)域，改用示差法測(cè)定時(shí)，透光率則是60%，讀數(shù)落在測(cè)量誤差很小的區(qū)域，從而提高了測(cè)定的準(zhǔn)確度。計(jì)算出來(lái)的c_x當(dāng)然比較準(zhǔn)確了。示差光度法測(cè)定的Δc即使很小，如果測(cè)量誤差為dc，雖然dc/Δc可能會(huì)很大，但*后測(cè)定的結(jié)果之相對(duì)誤差是dc/（c_x+Δc），而c_x相對(duì)于Δc而言是個(gè)相當(dāng)大的值，且十分準(zhǔn)確，因此相對(duì)誤差就大為降低，導(dǎo)致*后測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度必然提高。所以示差分光光度法可以準(zhǔn)確測(cè)定高濃度的試液，同樣示差分光光度法也可以用來(lái)測(cè)定低濃度的試液，水汽分析中用來(lái)測(cè)定微量硅的儀器——小硅表就是利用示差法設(shè)計(jì)的。