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薄層層析法黃曲霉**B1的測定
日期：2025-07-11 05:52
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摘要：
薄層層析法黃曲霉**B1的測定
一、原理
樣品中AFTB1經有機溶劑提取、凈化、濃縮并經薄層色譜分離后，在波長365nm紫外光下產生熒光，根據其在薄層板上顯示熒光的強度與標準品AFTB1*低檢出量產生的熒光強度比較來測定樣品中AFT B1的含量。
二、試劑
三氯甲烷（AR）
正己烷（AR沸程30-60）或石油醚（沸程60-90）
甲醇（AR）
苯 （AR）
乙腈 （AR）
無水乙醚（AR）
丙酮 （AR）
（以上試劑應重蒸，并應經檢驗對薄層色譜測定無干擾）
苯-乙腈(98:2)混合溶液
甲醇-水（55:45）混合溶液
三氟乙酸（AR）
氯化鈉（AR）
無水硫酸鈉（AR）
硅膠G（薄層色譜用）
5%次氯酸鈉溶液：稱取100g漂白精，加入500mL水，攪勻。另將80g工業(yè)用碳酸鈉（Na2CO3.10H2O）溶于500mL溫水中，倒入上述溶液中，攪勻，澄清過濾后貯存于帶橡皮塞的玻璃瓶中，用作**劑。
黃曲霉**B1標準貯備液：用百萬分之一的微量分析天平精密稱取1-1.2mgAFTB1標準品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀釋至100mL，避光置于4℃冰箱中保存。使用前用紫外分光光度計測定其濃度，再用苯-乙腈混合溶液調整其濃度為10ug/mL。（在350nm測定AFTB1的苯-乙腈溶液的吸光度，其摩爾消光系數為19800，可根據朗伯-比爾定律求出其濃度）。
黃曲霉**B1標準應用液I（1ug/mL）：吸取1.0mL10ug/mL的黃曲霉**B1標準貯備液于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容。
黃曲霉**B1標準應用液II（0.2ug/mL）：吸取1.0mL1ug/mL的黃曲霉**B1標準應用液I于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容。
黃曲霉**B1標準應用液III(0.04ug/mL)：吸取1.0mL0.2ug/mL的黃曲霉**B1標準應用液II于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液定容。
三、主要儀器
玻璃板：5×20cm
涂布器
色譜展開槽（25×6×4cm）
紫外光燈：100-125W，帶有波長365nm濾光片
微量注射器：20uL,10uL各一支
四、操作步驟
1、樣品預處理
稱取4g混勻的花生油樣品于小燒杯中，用20mL石油醚或正己烷，將其轉移到125mL分液漏斗中，用20mL甲醇-水溶液分數次洗燒杯，洗液并入分液漏斗中，振搖2分鐘，靜止分層后，將下層甲醇-水溶液移入**分液漏斗，再用5mL甲醇-水溶液重復提取一次，提取液并入**分液漏斗中。在**分液漏斗中加入20mL三氯甲烷，振搖2分鐘，靜止分層后，放出三氯甲烷層，經盛有約10g先用三氯甲烷濕潤的無水硫酸鈉的慢速濾紙過濾于50mL蒸發(fā)皿中，分液漏斗中再加5mL三氯甲烷提取一次，三氯甲烷層一并濾入蒸發(fā)皿中，*后用少量三氯甲烷洗過濾器，洗液并入蒸發(fā)皿中。在通風柜中，將蒸發(fā)皿于65℃水浴上揮干，然后放入冰盒上泠卻2-3分鐘，準確加入1mL苯-乙腈混合液，用帶橡皮頭滴管的管尖將殘渣充分混合，若有結晶析出，將蒸發(fā)皿取下，繼續(xù)溶解、混勻，晶體消失后用滴管吸取上清液轉移于2mL具塞試管中。
2、樣品測定
1>薄層板的制備
稱取約3g硅膠G，加相當于硅膠量的2-3倍左右的水，用力研磨1-2分鐘，至成糊狀后立即倒入涂布器內，推鋪成5×20cm、厚度為0.25mm的薄層板三塊。于空氣中干燥約15分鐘后，在100℃下活化2小時，取出放入干燥器中保存。
2>點樣
將薄層板邊緣附著的吸附劑刮凈，在距薄層板底端3cm的基線上用微量注射器滴加樣液和標準液：
**點：10uL 0.04ug/mLAFT B1 標液
**點：20uL樣液
第三點：20uL 樣液 + 10uL0.04ug/mL AFT B1 標液
第四點：20uL 樣液 + 10uL0.2ug/mL AFT B1 標液
要求點距邊緣和點間距約為1cm,樣點直徑約3cm,大小相同，點樣時可用電吹風冷風邊吹邊點。
3>展開
在展開槽內加10mL無水乙醚，將點好樣的薄層板預展12cm，取出揮干。再于另一展開槽內加10mL丙酮+三氯甲烷（8+92）混合溶劑，展開10-12cm，取出揮干。
4>結果觀察
將展開好的薄板放在365nm的紫外燈光下觀察：a.若**點無熒光或都無熒光。說明薄板或展開劑未制備好，需重新制備。b.**點有熒光，而其余三點無熒光。說明樣液中有熒光猝滅劑，樣液需重新制備。c.**點有熒光，**點無熒光，三、四點有熒光。說明樣液不含AFT B1或含量小于*低檢出量。d.四個點都有熒光。需做確證實驗后再進行定量。
5>確證實驗
于另一薄板上左邊依次點二個樣：
**點：10uL0.04ug/mL AFTB1標液
**點：20uL樣液
在以上兩點各加一小滴三氟乙酸（TFA），待反應5分鐘后，用電吹風熱風2分鐘，使溫度不高于40℃。
再于薄層板的右邊點以下二個點：
第三點：10uL 0.04ug/L AFTB1 標液
第四點：20uL樣液
同第3>步展開后，于紫外光下觀察樣液是否產生與AFTB1標準點相同的衍生物AFT B2a,未加TFA的第三、四點作空白對照。
6>稀釋定量
若**點的熒光強度比**點強，則根據其強度估計減少點樣體積，于另一薄板上點四個點：
**點：10uL 0.04ug/mLAFT B1標液
**點：10uL樣液
第三點：15uL樣液
第四點：20uL樣液
展開后取熒光強度與**點相同的樣點進行計算。
五、計算
X =
X ——樣品中AFT B1的含量ug/kg(ppb)
V1——稀釋前樣液的總體積mL
V2——出現同等熒光強度的稀釋后樣液點樣量uL
D ——樣液的稀釋倍數
