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薄層層析法黃曲霉**B1的測定

日期:2025-07-11 05:52
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摘要:
薄層層析法黃曲霉**B1的測定
 
一、原理
   樣品中AFTB1經有機溶劑提取、凈化、濃縮并經薄層色譜分離后,在波長365nm紫外光下產生熒光,根據其在薄層板上顯示熒光的強度與標準品AFTB1*低檢出量產生的熒光強度比較來測定樣品中AFT B1的含量。
 
二、試劑
三氯甲烷(AR)  
正己烷(AR沸程30-60)或石油醚(沸程60-90)
甲醇(AR)
苯 (AR)
乙腈 (AR)
無水乙醚(AR)
丙酮 (AR)
(以上試劑應重蒸,并應經檢驗對薄層色譜測定無干擾)
苯-乙腈(98:2)混合溶液
甲醇-水(55:45)混合溶液
三氟乙酸(AR)
氯化鈉(AR)
無水硫酸鈉(AR)
硅膠G(薄層色譜用)
5%次氯酸鈉溶液:稱取100g漂白精,加入500mL水,攪勻。另將80g工業(yè)用碳酸鈉(Na2CO3.10H2O)溶于500mL溫水中,倒入上述溶液中,攪勻,澄清過濾后貯存于帶橡皮塞的玻璃瓶中,用作**劑。
黃曲霉**B1標準貯備液:用百萬分之一的微量分析天平精密稱取1-1.2mgAFTB1標準品,先加入2mL乙腈溶解后,再用苯稀釋至100mL,避光置于4℃冰箱中保存。使用前用紫外分光光度計測定其濃度,再用苯-乙腈混合溶液調整其濃度為10ug/mL。(在350nm測定AFTB1的苯-乙腈溶液的吸光度,其摩爾消光系數為19800,可根據朗伯-比爾定律求出其濃度)。
黃曲霉**B1標準應用液I(1ug/mL):吸取1.0mL10ug/mL的黃曲霉**B1標準貯備液于10mL容量瓶中,加苯-乙腈混合溶液定容。
黃曲霉**B1標準應用液II(0.2ug/mL):吸取1.0mL1ug/mL的黃曲霉**B1標準應用液I于5mL容量瓶中,加苯-乙腈混合溶液定容。
黃曲霉**B1標準應用液III(0.04ug/mL):吸取1.0mL0.2ug/mL的黃曲霉**B1標準應用液II于5mL容量瓶中,加苯-乙腈混合液定容。
 
三、主要儀器
玻璃板:5×20cm
涂布器
色譜展開槽(25×6×4cm)
紫外光燈:100-125W,帶有波長365nm濾光片
微量注射器:20uL,10uL各一支
四、操作步驟
1、樣品預處理
   稱取4g混勻的花生油樣品于小燒杯中,用20mL石油醚或正己烷,將其轉移到125mL分液漏斗中,用20mL甲醇-水溶液分數次洗燒杯,洗液并入分液漏斗中,振搖2分鐘,靜止分層后,將下層甲醇-水溶液移入**分液漏斗,再用5mL甲醇-水溶液重復提取一次,提取液并入**分液漏斗中。在**分液漏斗中加入20mL三氯甲烷,振搖2分鐘,靜止分層后,放出三氯甲烷層,經盛有約10g先用三氯甲烷濕潤的無水硫酸鈉的慢速濾紙過濾于50mL蒸發(fā)皿中,分液漏斗中再加5mL三氯甲烷提取一次,三氯甲烷層一并濾入蒸發(fā)皿中,*后用少量三氯甲烷洗過濾器,洗液并入蒸發(fā)皿中。在通風柜中,將蒸發(fā)皿于65℃水浴上揮干,然后放入冰盒上泠卻2-3分鐘,準確加入1mL苯-乙腈混合液,用帶橡皮頭滴管的管尖將殘渣充分混合,若有結晶析出,將蒸發(fā)皿取下,繼續(xù)溶解、混勻,晶體消失后用滴管吸取上清液轉移于2mL具塞試管中。
2、樣品測定
1>薄層板的制備
   稱取約3g硅膠G,加相當于硅膠量的2-3倍左右的水,用力研磨1-2分鐘,至成糊狀后立即倒入涂布器內,推鋪成5×20cm、厚度為0.25mm的薄層板三塊。于空氣中干燥約15分鐘后,在100℃下活化2小時,取出放入干燥器中保存。
2>點樣
   將薄層板邊緣附著的吸附劑刮凈,在距薄層板底端3cm的基線上用微量注射器滴加樣液和標準液:
**點:10uL 0.04ug/mLAFT B1 標液
**點:20uL樣液
第三點:20uL 樣液 + 10uL0.04ug/mL AFT B1 標液
第四點:20uL 樣液 + 10uL0.2ug/mL AFT B1 標液
要求點距邊緣和點間距約為1cm,樣點直徑約3cm,大小相同,點樣時可用電吹風冷風邊吹邊點。
3>展開
   在展開槽內加10mL無水乙醚,將點好樣的薄層板預展12cm,取出揮干。再于另一展開槽內加10mL丙酮+三氯甲烷(8+92)混合溶劑,展開10-12cm,取出揮干。
4>結果觀察
將展開好的薄板放在365nm的紫外燈光下觀察:a.若**點無熒光或都無熒光。說明薄板或展開劑未制備好,需重新制備。b.**點有熒光,而其余三點無熒光。說明樣液中有熒光猝滅劑,樣液需重新制備。c.**點有熒光,**點無熒光,三、四點有熒光。說明樣液不含AFT B1或含量小于*低檢出量。d.四個點都有熒光。需做確證實驗后再進行定量。
5>確證實驗
于另一薄板上左邊依次點二個樣:
**點:10uL0.04ug/mL AFTB1標液
**點:20uL樣液
在以上兩點各加一小滴三氟乙酸(TFA),待反應5分鐘后,用電吹風熱風2分鐘,使溫度不高于40℃。
再于薄層板的右邊點以下二個點:
第三點:10uL 0.04ug/L AFTB1 標液
第四點:20uL樣液
同第3>步展開后,于紫外光下觀察樣液是否產生與AFTB1標準點相同的衍生物AFT B2a,未加TFA的第三、四點作空白對照。
6>稀釋定量
若**點的熒光強度比**點強,則根據其強度估計減少點樣體積,于另一薄板上點四個點:
**點:10uL 0.04ug/mLAFT B1標液
**點:10uL樣液
第三點:15uL樣液
第四點:20uL樣液
展開后取熒光強度與**點相同的樣點進行計算。
五、計算
                         
            X =  
                        
X ——樣品中AFT B1的含量ug/kg(ppb)
V1——稀釋前樣液的總體積mL
V2——出現同等熒光強度的稀釋后樣液點樣量uL
D ——樣液的稀釋倍數

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